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细菌耐药基因blaNDM常见亚型的环介导等温扩增检测技术
2020-06-24
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返回列表本标准规定了细菌耐药基因blaNDM常见亚型(blaNDM-1、blaNDM-4、blaNDM-5和blaNDM-9)的环介导等温扩增LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)检测技术的操作步骤。
规范性引用文件：
《GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法》、《GB/T 16489 水质 硫化物的测定 亚甲基蓝分光光度法》。
试验原理
本标准所应用的试验原理为：根据序列保守区域设计一对外引物、一对内引物和一对环引物特异性识别靶序列上六个独立区域，在Bst DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物焦磷酸镁白色沉淀产生，可以实现恒温扩增和快速检测，结果通过肉眼即可判定。
仪器设备
1、微量移液器：10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。
2、低温高速离心机：离心力20 000 g。
3、电热恒温水浴锅。
4、稳流稳压电泳仪。
5、水平电泳槽。
6、凝胶成像系统。
7、电子分析天平：精度0.001 g。
样品
在生物安全柜中，将采集的样品(如人或动物的肛拭子、鼻拭子或肝脏、脾 脏、脑等不同脏器组织等)无菌划线特异性筛选培养基或哥伦比亚血琼脂培养基，置37 ℃培养箱过夜培养12 h～18 h，获得细菌单菌落，经二次纯化后，挑取单菌落于BHI营养肉汤中过夜培养12 h～18 h，用于提取细菌基因组DNA。
DNA的提取
规范性引用文件：
《GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法》、《GB/T 16489 水质 硫化物的测定 亚甲基蓝分光光度法》。
试验原理
本标准所应用的试验原理为：根据序列保守区域设计一对外引物、一对内引物和一对环引物特异性识别靶序列上六个独立区域，在Bst DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物焦磷酸镁白色沉淀产生，可以实现恒温扩增和快速检测，结果通过肉眼即可判定。
仪器设备
1、微量移液器：10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。
2、低温高速离心机：离心力20 000 g。
3、电热恒温水浴锅。
4、稳流稳压电泳仪。
5、水平电泳槽。
6、凝胶成像系统。
7、电子分析天平：精度0.001 g。
样品
在生物安全柜中，将采集的样品(如人或动物的肛拭子、鼻拭子或肝脏、脾 脏、脑等不同脏器组织等)无菌划线特异性筛选培养基或哥伦比亚血琼脂培养基，置37 ℃培养箱过夜培养12 h～18 h，获得细菌单菌落，经二次纯化后，挑取单菌落于BHI营养肉汤中过夜培养12 h～18 h，用于提取细菌基因组DNA。
DNA的提取
收集过夜培养的待检细菌菌液1 mL(菌液浓度的OD600值大于1.0)到1.5 mL的EP管中，12 000 g离心2 min，彻底弃上清，取沉淀用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组总DNA，最后溶于50 μL灭菌水中，测定DNA的浓度，-20 ℃保存备用。
电泳及结果判定
保持稳定电压80 V，电泳20 min，电泳反应结束后，在阳性和阴性对照成立的情况下，出现瀑布样条带的泳道判为阳性，说明待测样品中含有超级细菌blaNDM基因(参见附录B：图1B泳道1和3)，不出现瀑布样条带的为阴性
